Raman spektroskopisi, maddelerin moleküler yapısını, kimyasal bileşimini ve fiziksel özelliklerini belirlemek amacıyla kullanılan, ışık saçılımına dayalı bir spektroskopi yöntemidir. Bu teknik, Hintli fizikçi C. V. Raman tarafından 1928 yılında keşfedilmiş ve 1930 yılında kendisine Nobel Fizik Ödülü’nü kazandırmıştır. Raman saçılması, gelen fotonların numunede bulunan moleküllerle etkileşime girmesiyle enerjilerinde meydana gelen değişimlere dayanır. Günümüzde Raman spektroskopisinin biyolojik analizlerde kullanım oranının son on yılda %30 artış gösterdiği rapor edilmiştir.

^{RAMAN (ARUM)}

Çalışma Mekanizması

Raman spektroskopisinin temelinde, monokromatik lazer ışığıyla aydınlatılan bir numuneden saçılan ışığın, elastik (Rayleigh) ve inelastik (Raman) bileşenlerinin ayrıştırılması yer alır. Raman saçılması, moleküllerin titreşimsel enerji düzeylerinde meydana gelen değişimlerle ilişkilidir. Tipik olarak kullanılan lazer dalga boyları arasında 532 nm, 633 nm ve 785 nm bulunur; özellikle 785 nm lazerler, floresans sinyalini %50’ye kadar azaltma avantajı sunar. Raman sinyalleri genellikle zayıf olup, relatif yoğunluk seviyeleri 10⁻⁶ düzeyindedir; bu nedenle yüksek hassasiyetli dedektörler ve uygun filtreleme sistemleri gereklidir.

^{E = hν enerjili bir foton tarafından uyarılan bir molekülün üç tip saçılması. En yaygın geçiş kalın oklarla işaretlenmiştir.(1)}

^{(A) Çeşitli Raman tabanlı teknikler için hedefin mekansal çözünürlüğünün ve özellik boyutunun gösterimi. (B) Çeşitli Raman tabanlı yöntemlerin hassasiyet ölçeği.(2)}

Avantajlar ve Kısıtlılıklar

Raman spektroskopisi, örneğe zarar vermeyen (tahribatsız), numune hazırlığı gerektirmeyen ve cam/plastik gibi kaplardan ölçüm yapılmasına olanak tanıyan bir yöntemdir. Su ile uyumlu olması, özellikle biyolojik örneklerde analiz yapılmasını kolaylaştırır. Ancak, düşük saçılma verimliliği ve floresans girişimi bu yöntemin temel sınırlamalarıdır. Floresans etkisini azaltmak için daha uzun dalga boylu lazerlerin (örneğin 785 nm) kullanımı, SERS (Surface-Enhanced Raman Spectroscopy) gibi yüzeyle geliştirilmiş tekniklerle sinyalin 10⁶ kata kadar artırılması mümkündür.

Uygulama Alanları

Raman spektroskopisi, kimya, biyoloji, malzeme bilimi, adli bilimler ve kültürel varlık analizinde kullanılmaktadır. Kimyasal bileşiklerin tanımlanması, polimerlerin yapı karakterizasyonu, hücresel biyomoleküllerin izlenmesi ve ilaç formülasyonlarının kontrolü gibi çok çeşitli kullanım alanlarına sahiptir. Yüzeyle Geliştirilmiş Raman Spektroskopisi (SERS) sayesinde, tek molekül düzeyinde tespit mümkündür. Türkiye’deki örnekler arasında, ODTÜ KÖRLS Laboratuvarı’nda yapılan polimer karakterizasyon çalışmaları ve Sakarya Üniversitesi SARGEM’in biyolojik örnek analizleri sayılabilir.

 ^{Raman spektroskopisi tek hücre analizi için bol miktarda olasılık sunar. Kısa sürede binlerce hücrenin edinilmesine olanak tanıyan yüksek verimli ekranlı Raman spektroskopisi sistemi (a).Hücreler parlak alan görüntüsünde otomatik olarak tanınır ve insan müdahalesi olmadan ölçülür (b).HTS-RS sisteminde edinilen üç farklı tip için binlerce lökositten alınan ortalama Raman spektrumları (c). Çok değişkenli istatistiksel analiz, bu hücrelerin moleküler imzalara göre kolayca ayrıldığını gösterir (d). Raman görüntüleri, farklı makromoleküllerin hücre içi dağılımının görselleştirilmesini sağlar (e).Raman tabanlı bir canlılık testi, canlı ve cansız hücreleri kolayca ayırt edebilir (f).Üç farklı hücre tipinin karakterizasyonu için düşük çözünürlüklü Raman spektroskopisinden alınan örnekler, azaltılmış spektral çözünürlükle bile hücrelerin ayırt edilebileceğini ve düşük maliyetli yüksek verimli sistemlerin uygulanmasına olanak sağladığını göstermektedir (g).(3)}

Teknik Varyasyonlar

Raman spektroskopisi, uygulama ihtiyaçlarına göre çeşitli tekniklerle çeşitlendirilmiştir. SERS (Surface-Enhanced Raman Spectroscopy), metal nanoparçacıklarla Raman sinyalini milyon kat güçlendirerek çok düşük derişimlerde bile analiz imkânı sunar. Konfokal Raman mikroskopisi, yüksek mekânsal çözünürlükle mikroölçekli alanların haritalanmasını sağlar. Zamanla çözünmüş Raman spektroskopisi ise geçici moleküler yapıların dinamiklerini incelemeye olanak tanır. Bu varyasyonlar, örneğin kanser hücrelerinin yapısal analizinde veya protein etkileşimlerinin gözlenmesinde kullanılmaktadır.