Ultraviyole-görünür spektrofotometresi (UV-Vis), 200–800 nm dalga boyu aralığında çalışan, ışığın madde tarafından absorpsiyonunu ölçen bir cihazdır. UV (200–400 nm) ve görünür (400–800 nm) bölgede ışık absorpsiyonu gerçekleştiren moleküller, karakteristik spektral tepkiler gösterir. UV-Vis spektroskopisi, kimyasal analizlerin yaklaşık %80’inde doğrudan veya dolaylı olarak kullanılmaktadır. Özellikle biyokimya laboratuvarlarında protein ve nükleik asit konsantrasyonlarının belirlenmesinde, çevre laboratuvarlarında su kalitesi analizlerinde ve ilaç sektöründe saflık kontrollerinde yaygın olarak tercih edilmektedir.

Bu yöntemin kuramsal temeli Beer-Lambert yasasına dayanır ve absorpsiyon, aşağıdaki formülle tanımlanır:

A=ε⋅l⋅c

Burada:

• A: Absorbans (birimsiz)
• ε: Molar absorptivite katsayısı (L·mol⁻¹·cm⁻¹)
• l: Küvet yolu uzunluğu (cm)
• c: Çözeltideki madde konsantrasyonu (mol·L⁻¹)

Molar absorptivite (ε) değeri, maddenin belirli bir dalga boyundaki ışığı ne ölçüde absorpladığını gösterir ve seçilen analitin analiz hassasiyetini belirler.

^{UV-VIS (ARUM)}

Çalışma Prensibi

UV-Vis spektrofotometresinde, bir ışık kaynağından çıkan ışık bir monokromatör yardımıyla seçilen dalga boyuna indirgenir. Bu ışık örnek içeren küvetten geçirilerek ışık şiddetindeki düşüş (transmittans) ölçülür. Bu düşüş, örneğin ışığı absorplama miktarına karşılık gelir.

Absorbans ile konsantrasyon arasındaki ilişki doğrusaldır ve tipik olarak ε= 10^4

L/mol·cm olan bir madde için %95 üzeri doğrulukla analiz yapılabilir. UV bölgesindeki elektron geçişleri özellikle π→π* ve n→π* geçişleri şeklindedir; bu geçişler genellikle konjuge çift bağlara veya heteroatomlara sahip yapılar tarafından gerçekleştirilir.

Monokromatörlerin dalga boyu çözünürlüğü genellikle 0.1 nm olup, seçici analizlerde yüksek ayırma gücü sağlar.

Bileşenler

1. Işık Kaynağı:

• Deuterium lambası: 200–400 nm aralığında çalışır ve %90 ışık verimliliği sağlar.
• Tungsten-halojen lambası: 320–800 nm aralığında görünür ışık sağlar.

1. Monokromatör:
2. Prizma veya ızgara sistemleriyle çalışır; seçici ışık üretimi sağlar.
3. Numune Küveti:
4. Kuvars malzemeden üretilmiş küvetler UV bölgede %99 geçirgenlik sunar. Küvet boyu genellikle 1 cm’dir.
5. Dedektör:

• UV bölgesi için: Fotomültiplikatör tüp (PMT) kullanılır; 10⁻⁴ lux seviyesinde ışık hassasiyeti sağlar.
• Görünür ve yakın IR için: InGaAs ve PbS dedektörler tercih edilir.

Kullanım Alanları

UV-Vis spektrofotometresi, çok çeşitli analitik uygulamalarda kullanılır:

• Protein analizleri: Proteinlerin aromatik aminoasitlerinden kaynaklı 280 nm’de absorpsiyonu %95 doğrulukla tayin edilebilir.
• DNA/RNA tayini: 260 nm’de absorpsiyon ölçümüyle nükleik asit konsantrasyonu belirlenir.
• İlaç analizleri: Farmasötiklerde saflık analizi %98 hassasiyetle yapılabilir.
• Çevre analizleri: Türkiye’de çeşitli çevre laboratuvarlarında UV-Vis cihazı ile su örneklerinde nitrat, nitrit ve fosfat gibi iyonlar analiz edilir.
• Reaksiyon kinetiği: Renkli veya UV aktif ara ürünlerin zamanla değişimi izlenerek reaksiyon hızları tayin edilir.

Spektrofotometre Türleri

• Tek Işınlı Sistem: Işık örnekten geçirilip doğrudan ölçülür; ekonomik ancak referans düzeltmesi yoktur.
• Çift Işınlı Sistem: Aynı anda referans ve numune ışın yolları kullanılır; bu sistemler %20 daha yüksek doğruluk ve kararlılık sağlar.
• UV-Vis-NIR Cihazları: 190–3200 nm aralığında çalışır. NIR bölgesi, özellikle polimerlerin optik bant aralığı tayininde kullanılır.

Avantajları ve Sınırlılıkları

Avantajlar:

• Yüksek analiz hızı
• 0.01 AU hassasiyet
• Düşük örnek hacmi gereksinimi
• Kantitatif analiz için uygundur

Sınırlamalar:

• Yalnızca kromofor içeren moleküller analiz edilebilir.
• Kompleks karışımlarda spektral örtüşme görülebilir; bu da ölçüm doğruluğunu %30 oranında azaltabilir.