Yanal Akış Testi (LFA)

Yanal akış veya lateral akış testleri olarak bilinen "lateral flow assay (LFA)", kullanıcılarına pek çok konuda avantaj sağlayan bir biyosensör sistemidir. Çalışma prensipleri kapiler akış yani sıvının dar bir boşlukta adhezyon kuvvetinin kohezyon kuvvetinden büyük olması sonucunda ilerleyebilmesi prensibine dayanmaktadır. Bir bakım noktası testi örneği yani point of care testi örneği olan LFA sistemleri; hızlı, kolay, düşük maliyetli, taşınabilir ve güvenilir sonuç sağlamaktadır. COVID-19, gebelik, RSV ve influenza gibi çeşitli virüsler, pestisit ve aflatoksin gibi toksinler, uyuşturucu gibi yasa dışı maddeler ve kronik rahatsızlıkların teşhisi için LFA prensibiyle oluşturulan test kitleri kullanılmaktadır.

SARS-CoV-2 Virüsü İçin Geliştirilen Yanal Akış Test Örnekleri (Pexels)

Hedeflenen analizi yapmak amacıyla sağlıklı kişiden veya hastadan test kitine alınan örneğe numune adı verilmektedir. Numunede tespiti yapılmak istenen asıl maddeye ise analit adı verilmektedir. Analitin varlığı veya yokluğuna ve test kitinin çalışma prensibine bağlı olarak, istenen analiz kullanıcı dostu bir şekilde elde edilmektedir.

Bileşenler

LFA sistemleri genellikle örnek ped, konjugat ped, membran, absorpsiyon ped ve altlık olmak üzere 5 temel kısımdan oluşmaktadır.

Yanal Akış Testinin İçindeki Formatı Gösteren Bir Görsel (Yapay Zeka İle Oluşturulmuştur)

Örnek Ped: Numunenin test kitine giriş yaptığı kısımdır. Malzeme olarak genellikle selüloz veya cam elyaf tercih edilmektedir. Selüloz daha kalın ve ucuz bir örnek ped elde edilmesini sağlarken, cam elyaf numuneye daha iyi çekme dayanımı oluşturarak konjugat ped üzerine eşit gönderimini sağlamaktadır. Örnek ped oluştururken önemli parametreler; toplam hacim ve gözenekliliğin çarpılması ile bulunan yatak hacmi, kalınlık ve partikül tutma oranıdır. Daha yüksek bir yatak hacmi numunenin emilimini arttırırken test kitinde daha yavaş bir akış sağlamaktadır. Hedeflenen test formatı ve analite bağlı olarak hız ayarlanmaktadır. Ayrıca genellikle numunede veya ortamda bulunan ama test kitinde istenmeyen yani spesifik olmayan maddelerin bağlanmasını önlemek ve numunenin pH'ını düzenlemek için örnek ped bloklama sıvısı örnek ped üzerine mikropipetle eklenmekte ve sonrasında uygun koşullarda kurutularak test kitlerinde kullanılmaktadır.

Konjugat Ped: Numune konjugat pedine ulaştığında burada bulunan algılama (detection) antikorların çözünmesini sağlayarak onları da kapiler akışa dahil etmektedir. Algılama antikorları; gümüş veya altın nanopartikülleri, enzim veya floresan gibi işaretleyici moleküllerdir. Numunenin konjugat pede gelişiyle çözünen bu moleküller sayesinde test ve kontrol çizgilerinde renk oluşumları gözlemlenmekte ve test sonucu belirlenmektedir. Konjugat ped oluştururken malzeme olarak selüloz, cam elyaf ve polyester gibi materyaller tercih edilmektedir. Uygun prosedürle hazırlanan algılama antikorları, hepsinin farklı bir prosedürü bulunmaktadır (gümüş ve altın gibi nanopartiküller santrifüjde çöktürüldükten sonra kullanılabilir). Ayrıca nanopartiküllerin stabil kalması, numunenin gelişiyle düzgün bir şekilde çözünme ve akış performansı gösterebilmeleri amacıyla konjugat ped bloklama sıvısı konjugat pede emdirilmekte veya püskürtülmekte, uygun koşullarda kuruma sağlandıktan sonra test kitlerinde kullanılmaktadır.

Membran: Algılama pedi olarak da anılan membranda test ve kontrol çizgileri bulunmaktadır. LFA sistemlerde kontrol çizgisinde genelde iyi bir yakalayıcı sabit sekonder antikor olan anti-IgG bulunmaktadır. Test çizgisinde ise testin formatına bağlı olarak yakalayıcı (capture) antikor veya antijen bulunmaktadır. Bu iki çizgi genellikle nitroselüloz malzemeden oluşan membran üzerine çizilmekte veya dispanser ile püskürtülmektedir.

Absorpsiyon Ped: Membrandan ulaşan numunenin fazlalığını emerek kapiler akışın devamlılığını sağlayan kısımdır. Bu pedin boyutu membrandan geçmesi gereken sıvının miktarına göre belirlenmektedir.

Altlık: Sırtlık olarak da isimlendirilen bu kısım test kitinin tüm alt yüzeyini kaplayan ve sağlamlık sağlayan bileşendir. Genellikle PVA malzeme tercih edilmektedir.

Bu bileşenler geliştirilen testin formatına uygun ölçülerde kesilerek hazırlanmaktadır. En son adımda kendinden yapışkanı olan altlık tabanının üzerinde hepsi uygun sırayla birleştirilmektedir. Geliştirilen test kitinde genellikle önce saf su ile negatif kontrol gerçekleştirilmektedir. Ardından pozitif kontrol için uygun maddeler ile denemeler sağlanmaktadır. Sonrasında başka bir maddeye de hedef analite olduğu şekilde pozitif cevap verip vermediğini anlamak için spesifisite testleri gerçekleştirilmektedir. Gerekli tüm denemeler test üzerinde gerçekleştirilip istenen özellikler sağlandıktan sonra ped ve membrandan oluşan test sistemine uygun bir paketleme gerçekleştirilmekte ve medikal sahadan uzak olunsa da kullanım kolaylığı sağlayan hızlı, güvenilir, kullanıcı dostu bir test kiti oluşturulmaktadır.

Çalışma Prensibi

LFA sistemleri numunedeki analitin büyüklüğüne göre sandviç veya yarışmalı format olmak üzere 2 farklı mekanizma ile üretilmektedir.

Sandviç Format

Bu format tipindeki testlerin test çizgilerinde analiz edilmek istenen ilgili hastalık veya virüsün antikoru bulunmaktadır. Kontrol çizgisinde de iyi bir yakalayıcı olduğu için genellikle anti-IgG antikoru kullanılmaktadır. Antijen olarak gelen analit, önce konjugatta bulunan antikorla bağlanmaktadır. Oluşan antikor-antijen molekülü ardından test çizgisindeki antikora bağlanmaktadır ve böylece analit olarak test kitine giren antijen iki antikor molekülü arasında bulunmaktadır. Antikorların antijenle bağ yapış şekli dolayısıyla sandviç format olarak isimlendirilmektedir. Protein ve antijen gibi büyük moleküllerin tespiti için kullanılan sandviç testleri; COVID, CRP, HCG testleri bu formatla oluşturulmaktadır. Bu testlerde çift çizgi pozitif anlamına gelirken, tek çizgi negatif anlamına gelmektedir. Bu formattaki testler için hamilelik testi en akılda kalıcı örnektir.

Yarışmalı Format

Bu format tipindeki testlerin test çizgisinde analiz edilmek istenen ilgili hastalık veya virüsün antijeni bulunmaktadır. Kontrol çizgisinde sandviç formatta olduğu gibi genellikle anti-IgG antikoru bulunmaktadır, fakat testin hedeflediği amaca yönelik olarak kontrol çizgisi oluşturmak amacıyla farklı bir antikor veya molekül kullanılmaktadır. Analit olarak ilgili hedefin antikoru seçilmektedir. Test kitine giren antikor, test çizgisinde bulunan antijenlere bağlanabilmek için konjugatta bulunan antikor ile yarıştığı için format bu şekilde isimlendirilmiştir.

Analit varlığında, işaretleyici olan algılama antikoru (genelde altın nanopartikül) analit ile rekabet ettiği için test çizgisine bağlanamaz ve bu nedenle test çizgisinde renk oluşmaz, dolayısıyla yarışmalı formatta tek çizgi testin pozitif olduğu anlamına gelmektedir. Analit yokluğunda ise, algılama antikoru test çizgisine bağlanmakta ve verdiği renk nedeniyle test çizgisi oluşmaktadır. Yani sandviç formatın aksine; analit yokluğunda, (test negatif iken) çift çizgi, analit varlığında (test pozitif iken) tek çizgi oluşmaktadır. Haplar, toksinler, hormonlar, yasa dışı uyuşturucu maddeler ve pestisit gibi küçük moleküllerin analizlerinde bu format ile oluşturulan LFA testleri tercih edilmektedir.

Yanal Akış Testi Örneği (Pexels)

LFA sistemlerinde, test sonucunda çift veya tek çizgi oluşuna bağlı olarak kalitatif bir analiz elde edilmektedir. Bu nedenle kantitatif analiz yani sayısal veri sağmaları bakımından zayıf gözükseler de özellikle hızlı ve pratik sonuç alma açısından avantaj sağlamaktadırlar.

Hem sandviç hem de yarışmalı formatta oluşturulan yanal akış testleri, uzun raf ömrüne sahip ve kullanıcı dostu olmaları ile günümüzde oldukça sık kullanılmaya başlamışlardır. Özellikle son yaşanan COVID-19 pandemisinden bu yana, bu testleri anlamaya ve geliştirmeye yönelik talepte de ciddi bir artış meydana gelmiştir. Halihazırda uzman kişiler tarafından laboratuvar ortamında daha uzun ve daha uğraştırıcı bir şekilde ELISA ve Western blot gibi uygulamalarla yapılmakta olan pek çok test, LFA sistemine uyarlanmaya çalışılmaktadır.